Предисловие Е. Д. Свердлова......7Предисловие М. С. Гельфанда......8Предисловие авторов......9Перечень компаний
упомянутых в тексте......11Список сокращений......12Глава 1. Обзор методов определения последовательности нуклеиновых кислот......131.1. Методы
основанные на детекции сигнала от множества одинаковых молекул ДНК (методы с предварительной амплификацией фрагментов ДНК)......141.2. Методы
основанные на детекции сигнала от одной молекулы ДНК (секвенирование одиночных молекул ДНК)......341.3. Другие методы секвенирования......40Список литературы......40Глава 2. Технологии создания библиотек фрагментов ДНК для NGS......432.1. Очистка нуклеиновых кислот для NGS......452.2. Оценка концентрации нуклеиновых кислот и полногеномная амплификация (WGA)......462.3. Способы разрушения ДНК для приготовления библиотеки......472.4. Оценка длин фрагментов ДНК......512.5. Присоединение адаптеров......522.6. Предварительная амплификация библиотеки......532.7. Отбор фракции фрагментов нужной длины (size-select)......532.8. Мечение смешиваемых образцов специфичными адаптерами («штрих-кодирование»)......562.9. Клональная амплификация фрагментов ДНК......572.10. Типы библиотек фрагментов ДНК для NGS......60Список литературы......65Глава 3. Коммерческие технологии высокопроизводительного секвенирования......663.1. Технология 454 Life Sciences компании Roche (эмульсионная ПЦР пиросеквенирование)......663.2. Технология SOLiD компании Life Technologies Thermo Fisher Scientific (эмульсионная ПЦР секвенирование лигированием)......693.3. Illumina Genome Analyser компании Illumina (мостиковая ПЦР секвенирование синтезом)......713.4. Платформы Ion PGM и Ion Proton компании Life Technologies Thermo Fisher Scientific (эмульсионная ПЦР полупроводниковое секвенирование)......743.5. Платформа PacBio компании Pacific Biosciences (секвенирование синтезом одиночных молекул)......783.6. Платформа Heliscope компании Helicos Biosciences (секвенирование синтезом одиночных молекул)......80Список литературы......84Глава 4. Общие принципы обработки данных NGS......854.1. Оценка качества первичных данных......854.2. Сборка геномов de novo......894.3. Алгоритмы сборки......914.4. Аппаратные и биологические особенности данных NGS......944.5. Объединение контигов в скэффолды......974.6. Вариации в близкородственных геномах......1004.7. Картирование прочтений при повторном секвенировании......1014.8. Поиск однонуклеотидного полиморфизма (SNP)......1044.9. Поиск структурных вариаций: протяженных вставок
делеций
инверсий и транслокаций......1054.10. Аннотация обнаруженных вариаций с использованием баз данных......1064.11. Предсказание функциональных и клинически значимых изменений белка на основе обнаруженных мутаций......107Список литературы......108Глава 5. Оборудование и программные решения для обработки данных NGS......1125.1. Локальные центры обработки данных NGS: архитектура и программные решения......1125.2. Программное обеспечение для локального центра обработки данных NGS......1165.3. Сетевые сервисы и простые решения для обработки данных NGS......1175.4. Специализированные проекты по обработке данных NGS......120Список литературы......121Глава 6. Планирование эксперимента с использованием NGS......1226.1. Общие принципы планирования биологических экспериментов......1226.2. Рандомизация в NGS......1236.3. Повторности в NGS......1246.4. Основные типы ошибок при секвенировании......1256.5. Варианты применения NGS......126Список литературы......127Глава 7. Секвенирование индивидуальных геномов и транскриптомов прокариот......1287.1. Роль NGS в микробиологии......1287.2. История секвенирования бактериальных геномов......1297.3. Определение полной последовательности бактериального генома de novo......1307.4. Пример протокола секвенирования образца бактериальной ДНК......1327.5. Анализ данных геномного секвенирования бактерий......1417.6. Секвенирование транскриптома прокариот......142Список литературы......145Глава 8. Исследование микробных сообществ методами NGS......1468.1. Очистка ДНК для метагеномных исследований......1478.2. Анализ микробного сообщества секвенированием ампликонов......1488.3. Метагеномное секвенирование......1518.4. Биоинформатический анализ данных метагеномного секвенирования......1528.5. Комбинированный алгоритм анализа таксономического состава сообщества......1548.6. Сравнение метагеномов между собой......1558.7. Метатранскриптом......155Список литературы......157Глава 9. Секвенирование геномов эукариот......1629.1. Общие аспекты секвенирования сложных геномов......1629.2. Секвенирование эукариотических геномов de novo......1649.3. Повторное секвенирование (ресеквенирование)......1669.4. Фазирование при ресеквенировании диплоидных геномов......1699.5. Секвенирование генома отдельной клетки......171Список литературы......174Глава 10. Секвенирование транскриптомов эукариот......17610.1. Применение NGS для исследования РНК......17610.2. Общие моменты очистки РНК и синтеза кДНК......17810.3. Ферменты для обратной транскрипции......18010.4. Подготовка библиотеки к ДНК для NGS......182Список литературы......188Глава 11. Повышение концентрации определенных последовательностей в библиотеке для NGS (таргетное секвенирование)......19111.1. Параметры методов целевого обогащения......19111.2. Обогащение библиотеки фрагментов ДНК только на основе ПЦР......19211.3. Обогащение библиотеки фрагментов ДНК при помощи гибридизации с пробой......19811.4. Обогащение при помощи гибридизации в растворе с отбором методом ПЦР (инвертированные молекулярные пробы)......20111.5. Обогащение библиотеки белок-связывающими последовательностями хроматина (ChIP-Seq)......203Список литературы......206Глава 12. Применение высокопроизводительного секвенирования в медицинской практике......20712.1. Генетическое тестирование с использованием NGS......20712.2. Исследование патогенов и микробиома человека......220Список литературы......222Глава 13. Перспективы высокопроизводительного секвенирования......223Список литературы......227Предметный указатель......228